بهینه‌سازی روش کشت‌ بافت و سیستم انتقال ژن در گیاه کاهو (Lactuca sativa L.)

نوع مقاله : مقالات پژوهشی

نویسندگان

چکیده

چکیده
گیاه کاهو (Lactuca sativa L.) از جمله سبزی‌های برگی متعلق به خانواده چتریان (Asteraceae) می‌باشد. دستکاری ساختار ژنتیکی کاهو نیازمند یک روش پایا و موثر کشت بافت و انتقال ژن می‌باشد. با توجه به اینکه گیاه کاهو یک بیوراکتور بسیار مناسب به منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب به ویژه واکسن‌های خوراکی است لذا در قالب این پروژه تحقیقاتی سعی شده است علاوه بر بهینه‌سازی سیستم کشت بافت این گیاه، مکانیسم مناسب انتقال ژن به آن تعیین گردد. ابتدا اثرات سن ریزنمونه کاهو ( کوتیلدون‌های 3 و 7 روزه ژنوتیپ محلی اهواز) و 7 ترکیب مختلف از هورمون‌های رشد گیاهی بر روی القا کالوس و شاخه‌زایی مستقیم آزمایش شد. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی اجرا شد. حساسیت کوتیلدون‌های کاهو به آنتی‌بیوتیک هیگرومایسین با کشت کوتیلدون‌ها روی محیط انتخابی دارای غلظت‌های مختلف هیگرومایسین ارزیابی شد. برای انتقال ژن از آگروباکتریوم سویه LBA4404 حاوی پلاسمید pCAMBIA1304 استفاده شد و روش PCR برای بررسی گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گرفت. بالاترین میزان القا کالوس با استفاده از محیط کشت M1 حاوی 54/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولارBA برای نمونه‌های کوتیلدونی 7 روزه بدست آمد. همچنین تعداد بالای شاخه‌زایی مستقیم در محیط‌های کشت M1 (حاوی 54/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولار BA) و M7 (حاوی 1/0 میکرومولار NAA و 44/0 میکرومولار BA) حاصل شد. مقدار 15 میلی‌گرم در لیتر هیگرومایسین بطور کامل از باززایی نمونه‌های غیر تراریخت جلوگیری کرد و بنابراین غلظت 15 میلی‌گرم در لیتر از آنتی‌بیوتیک در محیط کشت انتخابگر استفاده شد. شرایط بهینه‌ای برای تراریختگی، از هم‌کشتی ریزنمونه‌های کوتیلدونی با آگروباکتریوم در محیط MS بدون هیچ تنظیم کننده رشدی بدست آمد. آنالیزهای اولیه گیاهان باززایی شده در محیط انتخاب‌گر، در سطح DNA و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن hph صورت پذیرفت و گیاهان تراریخته انتخاب شدند.

واژه‌های کلیدی: کاهو، دستورزی ژنتیکی، کشت بافت، شاخه‌زایی مستقیم، ژن انتخابگر hph

عنوان مقاله [English]

Optimization of Tissue Culture and Gene Transfer in Lettuce (Lactuca sativa L.)

نویسندگان [English]

  • M. Mohebodini
  • M. Jalali Javaran
  • .h Alizadeh
  • F. Mahboodi
  • H. Khosravi
چکیده [English]

Abstract
Lettuce (Lactuca sativa L.) is a major leafy vegetable and belongs to the Asteraceae family (Compositae). The genetic manipulation of lettuce requires a reliable and efficient regeneration method. Since lettuce is a suitable bioreactor for production of recombinant proteins especially edible vaccines. This study was conducted to identify an appropriate method for lettuce gene transformation. At first, the effects of explants age and seven different combinations of plant growth regulators on callus induction and direct shoot regeneration of lettuce were examined. The experiment was factorial based on a completely randomized design. The sensitivity of lettuce cotyledons to hygromycin was assayed by culturing the cotyledons without co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens on selection medium containing different concentrations of hygromycin. For gene transformation, Agrobacterium tumefaciens (LBA4404 with pCAMBIA1304) was used and transgenic plants were analyzed with PCR method. The highest percentage of callus induction was obtained using 0.54 µM NAA and 0.44 µM BA on 7 days old cotyledon explants. The highest number of direct shoot regenerations was also obtained using M1 (0.54 µM NAA and 0.44 µM BA) and M7 (0.1 µM NAA and 0.44 µM BA) media. Hygromycin with a concentration of 15 mg.l-1, completely inhibited the regeneration from untransformed explants and it was therefore used in selection medium. Optimal transformation conditions were obtained by co-culturing cotyledon explants with Agrobacterium tumefaciens in MS medium without any plant growth regulators for 72 hours. Primary analysis of regenerated plants in DNA level was conducted by specific primers for hph gene and transgenic plants were screened for further studies.

Keywords: Lettuce, Genetic manipulation, Tissue culture, Direct shoot regeneration, hph selectable gene